讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-1

      《光密度值和灰度值如何在Western Blot條帶定量和凝膠圖像分析中應用？》提到了灰度值在圖像中的涵義和在Western Blot條帶蛋白定量分析中的適用問題。

       本文采用美國伯樂公司公開發(fā)表實驗資料Bulletin，基于圖像灰度值分析法，按ImageJ 1.46R操作指南，對實驗圖像進行分析回溯，用從圖像分析取得的數(shù)據(jù)構(gòu)建標準曲線，重構(gòu)各檢測條帶蛋白含量對比關(guān)系。通過與公開實驗數(shù)據(jù)曲線間的對比，評估圖像分析數(shù)據(jù)對實驗資料披露數(shù)據(jù)的再現(xiàn)、還原程度，探究圖像灰度值數(shù)據(jù)用于Western Blot條帶定量分析的操作流程、方法創(chuàng)建過程，同時檢驗該分析方法在蛋白免疫印跡檢測分析中應用的可行性。

1 材料和方法

1.1 圖像來源及基礎工作準備

      原圖引自《Bulletin 6305：Clarity and Clarity Max Western ECL Substrates》(Ver D)中“Fig. 3. Comparison of chemiluminescent substrate signal intensity”一節(jié)中Clarity Max測試組實驗結(jié)果的.bmp格式圖像。

      蛋白電泳實驗：純化IKBα，上樣量700pg (band 1)，470pg (band 2)，310pg (band 3)，210pg (band 4)，140pg (band 5)，90pg (band 6)，60pg (band 7)，40pg (band 8)，30pg (band 9)；Western Blot化學發(fā)光底物為Clarity Max Western ECL Substrates（Bio-Rad）;SDS-PAGE電泳采用Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型蛋白垂直電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)印采用Trans-Blot Turbo 快速蛋白轉(zhuǎn)印儀、免疫印跡分析檢測平臺為Bio-Rad ChemiDoc Western化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，曝光時間70秒。

      將圖像用Adobe Photoshop 13.0.1簡體中文版執(zhí)行“圖像-調(diào)整-反相”操作（也可用Win 7的“附件-畫圖”工具進行反相處理），“技術(shù)還原”為基于CCD原理的ECL免疫印跡成像系統(tǒng)采集到圖像的本來面目（CLIA-style）后，將圖像保存為.tif格式備用。

1.2分析軟件

       ImageJ 1.53g（Java 1.8.0-internal，32-bit，http://cnij.imjoy.io/）；

       操作系統(tǒng)win 7旗艦版(32位)，Google Chrome 瀏覽器，MS office 2010 Plus(32位)。

1.3圖像灰度值法分析操作

1.3.1 圖像分析前的調(diào)整

        啟動網(wǎng)頁版ImageJ 1.53g后，打開圖像文件CLIA-style.tif。

        啟用Image→Transferm→Rotate 90 Degrees Right命令，將圖像順時針旋轉(zhuǎn)90°。

1.3.2 建立ROI

       采用方形工具，依次框選9個條帶，建立9個ROIs并添加到ROI Manager（ROI管理工具）中。

       測試中以圖像中各條帶為對象(Object)創(chuàng)建的ROI，詳情如下。

Table 1  Area and XY coordinates of the ROIs

       Western Blot實驗圖像各條帶分析選區(qū)創(chuàng)建方法，可參考《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》等文章。

1.3.3背景扣除方法的創(chuàng)建

       在Process→Subtract Background下拉菜單中調(diào)出Subtract Background對話框，設定背景扣除滾動圓球半徑（Rolling ball radius），并根據(jù)各條帶周圍背景情況不同，勾選平滑拋物線(Sliding paraboloid，SM)、禁用smoothing算法計算背景（Disable smoothing，DSM）選項。

       由于所選Clarity Max Western ECL 底物標記組圖像的背景本底不均勻，且存在大面積、強干擾區(qū)域，故采用“一帶一景”策略。在對所有選區(qū)評估基礎上，對各選區(qū)分別采用優(yōu)化背景扣除實施方案。本測試設定的背景扣除算法詳情見表2（在Western Blot條帶定量分析的背景扣除中如何計算滾球半徑、如何進行條件設置和優(yōu)化的問題另行討論，可參考《用Rolling ball為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤》、《Western Blot條帶分析中如何計算ImageJ的滾球半徑？》及《Western Blot條帶分析中如何設置ImageJ的背景扣除選項》等有關(guān)文章）。

Table 2  Subtract Background Command Setting of the ROIs

1.3.4 分析參數(shù)設定

       在Analyze→Set Measurements下拉菜單中調(diào)出Set Measurement勾選Area（選區(qū)），Min & max gray level（選區(qū)內(nèi)像素最小灰度值和最大灰度值），Mean gray value（選區(qū)平均灰度值），Integrated density（選區(qū)積分密度值/積分強度值）；Decimal places（檢測結(jié)果保留到小數(shù)點后位數(shù)）選0。

1.3.6 測定和保存

       在ROI Manager中左邊選中目標ROI，點擊右側(cè)的Measure。將彈出Results窗口，顯示上一步選定參數(shù)的計算結(jié)果。

       點擊Results彈窗中的File菜單，軟件默認保存路徑和文件名為【C：\user\當前用戶\下載\Results.csv】,文件名可以自行命名。

       以band-1選區(qū)IntDen測試值為基準，將其他band 1～band 8的強度值與band-1值的比值作“歸一化”處理。

       同時，按相同辦法，計算各帶原始蛋白上樣量比值。

       最后，將各選區(qū)IntDen值比值與各條帶蛋白載量比值分別繪制標準曲線，添加曲線的趨勢線和趨勢線指數(shù)方程。

2 結(jié)果

2.1條帶灰度值法測試計算結(jié)果

Table 3  Results of CLIA-style

       Table 3顯示，采用Western Blot 免疫印跡ECL化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集的黑底圖像獲得的選區(qū)灰度積分值比值與對應條帶的原始蛋白上樣量比值存在高度關(guān)聯(lián)。

       根據(jù)Table 3繪制的選區(qū)灰度值比值和蛋白上樣量比值標準曲線圖如下所示。

       Western Blot條帶圖像測試值與蛋白載量標準曲線圖

       圖像散點曲線圖顯示：根據(jù)各條帶選區(qū)的灰度積分值歸一化數(shù)據(jù)構(gòu)建的指數(shù)趨勢線軌跡，與依托蛋白初始上樣量數(shù)據(jù)曲線的趨勢線，軌跡存在高度吻合，兩個趨勢線方程的常數(shù)值高度接近，且各方程與趨勢線存在高度關(guān)顯著（R2＞0.998）（未完待續(xù)）。