應用驅動型qPCR儀選型攻略-6

       伯樂MyiQ實時PCR儀配有一FAM/SYBR Green I熒光檢測通道，具備基因表達、基因拷貝數、陰陽判定等基礎分析功能。 

       Eppendorf Mastercycler ep realplex 2和伯樂DNA Engine Option 2代表的FAM/SYBR Green I和HEX/TET/VIC雙通道熒光檢測系統，可在一個反應孔中同時檢測兩種熒光信號，使基因表達雙重PCR檢測(Duplex)、復雜SNP基因分型實驗成為可能。但2個通道實時熒光PCR儀，不能檢測620nm波長信號，無法使用TaqMan Universal PCR Master Mix這類含ROX參比熒光染料的試劑，限制了進行更復雜Multiplex定量分析或諸如LC Red 640一類染料標記TaqMan探針檢測。于是，3通道的QuantiStudio 1和Stepone，4通道的QuantiStudio 3、SteponePlus和Stratagene Mx3000P、5通道的7500 Fast、QuantiStudio 6 Pro和CFX Opus 384等）和6通道的QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Flex、CFX96-Touch和CFX Opus 96等多檢測通道qPCR儀應運而生。不僅方便了Triplex、quadraplex、five-target甚至six-target這類多靶標同步定量分析，還為系統兼容FRET雙雜交探針應用提供了關鍵硬件支持。 

       2008年，LightCycler 480 II首開6個熒光檢測通道記錄，伯樂CFX 96、ABI Viia7于2010年前后腳尾隨而至。競爭驅動下，實時熒光定量PCR儀新一輪擴充熒光通道數量的革命快要來了嗎？

一、qPCR儀熒光信號采集流程的分析 

       實時熒光數據采集（Data Collection or Plate Read）時間點因實驗類型而有區別。對于定量分析實驗，無論是SYBR Green I染料，還是熒光染料標水解探針、FRET雙雜交探針，通常是在PCR延伸步驟進行數據收集。 

       PCR退火溫度是指體系中50%引物處于與模板結合狀態時的溫度。這一常識告訴我們，反應孔內引物、探針與模板片段的特異性結合并非頃刻間同步完成的，而是有一個持續數秒鐘時間的過程。故熒光數據采集是個動態過程，系統自動生成多個時間點，最終將多個時間點采集數據均值代表本循環熒光數據并存儲。 

       安捷倫Mx3000P qPCR系統中，用戶通過軟件的“高級算法設置”選項可對每個循環中熒光數據采樣次數設置（設定范圍1-31，默認為3次）。系統自動計算完成指定數量采樣所需的總讀板時間、決定每一論循環的首個數據采集啟動時間。如，間隔7秒鐘采樣一次，每個循環收集數據3次，則系統將在每一循環的延伸步驟倒數第21秒這個時間點啟動熒光數據采集（For example, if reading a plate takes 7 seconds and the specified number of data collection points is 3, the system will begin collecting data when 21 seconds remain in the plateau or ramp.）。如延伸步驟時間設定低于21秒，系統將提示時間設置無效。 

       默認情況下，ABI PRISM 7700 Sequence Detection System每隔7秒中在PCR循環的延伸階段進行一次熒光信號采集。CCD每次曝光持續時間25毫秒（可設定范圍為5-255毫秒）。增加曝光時間可增加熒光信噪比，有助于提高檢測性能。但延長曝光時間會產生2個不良后果：一是增加可能引發CCD過飽和，二是增加單次曝光時間后，特定PCR延伸時長內系統數據采集次數須減少（fewer data points are collected in a given extension time），而這將影響檢測結果的準確性。若想要維持數據收集次數，則必須增加延伸保持時間。 

       資料表明，ABI PRISM 7700和Viia7系統軟件內置算法會在PCR循環的延伸步驟后半段采集的3個數據的平均值來代表此循環的熒光數據信號強度值。延伸的時間至少為30秒，以確保延伸步驟期限完成數據采集操作（For best results, the extension step should be at least 30 seconds to allow collection of sufficient data.） 

       7700系統將這一步時間設定為60s，目的是在首次熒光數據采集前留出39s時間，達到常規三溫度循環中退火所需30s時長，確保雙鏈延伸得有效啟動和持續一定時間。由于常規三步溫度循環法擴增流程中，72℃延伸步驟時間通常不超過30s，不符合7700系統熒光數據采樣設計要求。

       因此，眾多實時熒光定量PCR試劑使用指南通常會提示，擴增時應根據所用儀器型號來設定延伸步驟的時長。如規定Roche、Bio-Rad和Agilent的qPCR儀的延伸時間不低于15s，ABI 7000/7300時間至少為31秒。 

       《實時熒光定量PCR反應雙溫循環法的合理性及局限性》討論了qPCR實驗擴增的雙溫循環法。人們為常規短片段序列專門建立了anneal-extension兩步溫度循環法。其中一個重要原因就是這樣的退火/延伸合并步驟的時間設定具有極大靈活性，既有效滿足實驗PCR擴增產量和特異性要求，又打破了傳統三溫度循環法中常用的延伸步驟中的時間長度不夠的約束，適應了熒光信號采集的精準度要求。此后，人們在此基礎上將60s時間壓縮為45s，以縮短qPCR反應時長，提供實驗效率。 

二、快速PCR反應模式和多色熒光檢測帶來的新挑戰 

       需注意，7秒間隔和60℃最低維持30秒時長僅是標準反應速度模式下單色熒光檢測所需反應條件。 

       如《PCR升降溫速度在實時熒光定量PCR實驗中的作用與意義-下》所述，若用7500 Fast、QuantiStudio 3/5/6/7、StepOnePlus系統的快速PCR模式，則擴增循環各步驟持續時間大幅縮短，延伸時長不過10-15s。系統須啟用Fast模式實施熒光數據采集，即每個循環采集次數不變而縮短采樣時間間隔（3秒以內），才能完成數據的有效采集。 

       若要進行multiplex多色熒光實驗，每次數據采集前須進行設定熒光通道輪換這一必需動作。我們LightCycler 480實時熒光定量PCR儀為例予以說明。

       LightCycler 480的熒光通道包含6個發射熒光濾鏡，安裝于步進電機驅動的濾鏡輪中。在multiplex分析中，各熒光檢測通道是一組組依次旋入旋出檢測工位完成相應波長熒光數據的采集。濾鏡輪單次切換通道時間約0.65秒，這意味著完成5色熒光檢測時，Cyan 500通道信號采集時間點比CY5通道早3.25s，不同檢測通道熒光數據的時效性不一。 

       加大濾鏡輪直徑以容納更多濾鏡的研發成本和進行更多色熒光檢測的必要性拋開不論，但檢測通道數量增加伴隨的技術風險則應引起重視。 

       首先，檢測通道輪換時濾鏡輪需反復啟動、剎車，產生檢測時間遲滯。檢測通道越多，機械運動延遲也增多，完成全部熒光通道切換所需時間必然增加。 

       其次，也是最關鍵的，就是熒光通道越多，會造成不同熒光探針標記樣品的信號采集時間差距被放大。LightCycler 480系統這一時差將由目前的3.9秒飆升至4秒以上。其結果是，同一反應孔，靶標1檢測時間比靶標5時間提前了4秒，意味著靶標1的延伸時間比靶標5足足少了4秒鐘。延伸反應時長的差別，勢必造成靶標1擴增產物量的在采樣點存在輕微差異，從而出現熒光通道測試值“后發優勢”偏差現象。 

       其次是，在每輪數據采集時間期限內，CCD數據采集可用時長被壓縮。檢測通道達到10個以上時，系統須將延伸步驟的首次數據采集時間點提前，或整體延長延伸階時間，方可有效完成數據采集，這必將使每輪熒光數據檢測值隨之改變。 

       伯樂CFX系列實時熒光定量PCR儀光學檢測系統為光梭式（optics shuttle）結構設計。光梭移動呈“弓”字形軌跡，從A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12完成整板信號采集。采集某一種熒光信號時，步進馬達驅動特定檢測光路移動到被檢測反應孔正上方并精確對準反應孔后再啟動熒光的激發和信號采集，隨后移出工位。

       資料顯示，CFX Opus 96、CFX 96-touch實時熒光定量PCR儀96孔板完成FAM通道掃描耗時3s，完成5色熒光采集所需最短時間為12s（考慮通道切換的時間遲滯，實際時長大于12s）。這表明：CH1通道(FAM)與CH5通道(Quasar 705/Cy5.5)的熒光信號采集時間存在高度異步現象，采樣點時差達12s之多。本應與第1個靶標同步數據采集的第5靶標，額外增加了12s延伸反應時間。這必然改變采用不同熒光標記靶標間熒光數據的真實、等效對比。

       Multiplex分析所用熒光檢測通道越多，不同靶標熒光數據采集時間差距越大，檢測數據組間結果對比的失真現象越嚴重。 

表1 Optical Detection Performance Specifications of CFX Opus system 

       因此，目前普遍采用的qPCR光學模塊結構設計，已對進一步增加檢測通道的數量構成制約。 

       除非qPCR借鑒流式細胞儀的固定光路系統和空間立體激發技術。否則，進一步增加熒光檢測通道不僅面臨研發成本難題，更重要的是會直接危害Multiplex等多色熒光檢測實驗數據的可靠性、可信性。  

參考文獻

［1］MxPro QPCR Software Instruction Manual for Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems(Software version 4.10)
［2］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)
［3］LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5
［4］CFX Opus 96 and CFX Opus 384 Real-Time PCR Systems Instrument Guide