一、樣品模塊的變溫速度決定PCR實驗效率
MIQE指南成文之時，Applied Biosystems的7300（96×0.2ml/4色）、7500 Fast（96×0.1ml/5色）、StepOne（48×0.1ml/3色）及StepOnePlus（96×0.1ml/4色）風頭正盛。伯樂擁有MyiQ（96×0.2ml/單色）及iCycler iQ（96×0.2ml/4色），一看差點事，乘機并購了MJ Research公司，把DNA Engine Opticon 2（96×0.2ml/雙色）和Chromo 4（96×0.2ml/4色）改換門庭后，又推出MiniOption（雙色）、iQ5（96×0.2ml/5色）qPCR儀。羅氏先有LightCycler 1.5（32×20μl毛細管/3色）上市，后主推大眾化的LightCycler 480 II（96×0.2ml或384孔板/6色）。同期Stratagene Mx3000P（96×0.2ml/4色）/Mx3005P（96×0.2ml/5色）因2007年美國并入Agilent而一息尚存。但eppendorf Mastercycler ep realplex2 (96×/0.2ml雙色)、realplex4 (96×0.2ml/4色）則成為了歷史。Qiagen死扛配置72×100μl、100×30μl離心式轉頭的Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀，前景堪憂。
表1 部分經典型號qPCR系統工作性能參數表
品牌
型號 ABI 7300 ABI 7500 Fast MJ Research
DNA Engine Opticon 2 Bio-Rad
iQ5 Roche
LightCycler 480 II
上市時間 2004年 2005年 2002年 2005年 2008年
模塊升溫速率 1.6℃/s 5.5℃/s 3.0℃/s 96×0.2ml模塊:升3.3℃/s，降2.2℃/s;
雙48×0.2ml模塊:升2.2℃/s，降1.8℃/s;
384孔模塊:升2.0℃/s，降1.8℃/s; 4.8℃/s
樣品升溫速度 1.1℃/s - - - 3.3℃/s
模塊溫控精度 ±0.25℃ of setpoint ±0.25℃ of setpoint ±0.3℃ of setpoint ±0.3℃ of setpoint ±0.2℃ of setpoint
模塊溫度均一性 ±0.50℃ ±0.50℃ ±0.4℃ ±0.4℃ ±0.2℃
常規應用中，qPCR儀工作時程是由PCR程序運行進度決定的。樣品溫度在變性、退火和延伸三個溫度臺階轉換的快慢完全取決于模塊變溫速度。同一個模板、相同組分體系，反應模塊熱升降溫速度不同，執行同一PCR程序耗時大不相同。尤其是變性-退火轉換步驟，溫差高達35-40℃，不同熱循環模塊溫度切變耗時懸殊。
以Veriti PCR儀主板預置的“常規PCR擴增程序”為例：94℃預變性1min→95℃變性15s+55℃退火15s+72℃延伸30s共35個循環→最后72℃延伸7分鐘結束反應→4℃保溫。每個循環中樣品處于有效工作溫度時長僅1分鐘，但須經歷一次94℃→55℃相對較慢的降溫過程和一次55℃→72℃相對快速的升溫過程。
 
如果把55℃→72℃進程喻為田徑百米決賽，則94℃→55℃轉換過程就相當于20公里競走。東京奧運會蘇炳添成績9.98s排名第六，但與冠軍成績僅區區0.18s之差。競走決賽中，選手王凱華排名第七但要比奪冠成績落后了228s。選手速度實力差距放到拉長的賽程后，就變得顯而易見。不同考查機型在進行PCR循環中這一升一降兩個動作耗時差距道理亦是如此。
qPCR儀用戶指南通常標明了儀器安裝運行的海拔高度、環境溫度、濕度、通風條件參考范圍。而熱循環模塊降溫速度除了環境條件還受所加載樣品體積的制約。每個型號實時定量PCR儀實際降溫速度，除了具體現場測試別無他法。我們討論模塊變溫速度，其實是基于“模塊升溫速度快，散熱效率理應較高”的假設和經驗估算而已，并無真憑實據。
弱以實時熒光定量PCR儀額定變溫速率估算PCR循環的升降溫過程，將得到表2的結果。
表2 PCR循環變溫過程時長估算數據表
qPCR儀型號 7500 QuantStudio 1 CFX connect QuantStudio 5 CFX opus 96
模塊升溫速度 2.5℃/s 3.5℃/s 5.0℃/s 6.5℃/s 5.0℃/s
變溫測算標準 樣品升溫1℃/s
樣品冷卻 1.5℃/s 樣品變溫均速1.88℃/s 模塊變溫均速3.3℃/s 樣品變溫最大速度3.66℃/s 模塊變溫均速3.3℃/s
95→55℃過程 27s 22s 13s 11s 13s
55→72℃過程 17s 9s 6s 5s 6s
循環變溫耗時 44s 31s 19-30s 16-30s 19-30s
結果顯示，不同代差qPCR系統升溫過程中耗時差別可達2倍。但最大升溫速度5℃/s-6.5℃/s的機型間比較，升溫過程時長區別不大。
儀器標稱Peak Ramp Rate，是熱循環模塊按默認最高變溫速度模式運行時瞬時速度極限，與實際穩定運行升溫速度（以2-4℃居多）有相當差距。因此，有人認為，品牌PCR儀熱循環模塊實際變溫速度差并不大，以每個循環時差20秒、35個循環計算，時差不過12分鐘，完全可以忽略。其實這種論點不妥，原因有二。
一是不完全符合事實。模塊工藝技術代差相同的PCR儀，如GeneAmp 2720和伯樂Mycyler，二者完成相同protocol時長固然接近。但模塊變溫性能差距拉大到一定程度后，如2720 VS SimpliAmp PCR儀，恐怕2720的慢條斯理的節奏難免遭到吐槽。這一點，eppendorf官方實測報告可以佐證。
 
其二論據存在疏漏。人們只盯著升溫速度，卻忽略了94℃→55℃過程降溫速度這個關鍵瓶頸因素。PCR循環相當部分時間其實就浪費在這一步。
若降溫速度以2.0℃/s估算，圖中的程序降溫時長差不多是升溫耗時的3-4倍。7500和QuantStudio 1兩款機型降溫速率相差僅0.4℃/s，但前者耗時近30秒，后者為20s左右，完成單次循環二者耗時相差超過10秒。可見，在PCR熱循環中，降溫速度的微小差異會在實際運行中被數倍放大，從而明顯拉大不同qPCR系統任務完成時差。伯樂Mycycler PCR儀（最快升溫速度2.5℃/秒）完成35個循環擴增，耗時據稱超過2個半小時。當今主流96×0.2mL標準模塊SimpliAmp PCR儀及QuantStudio 3 qPCR儀，完成35個標準曲線定量實驗流程，運行時長不會超過2小時。
同種反應模塊配置，快速變溫能力，意味著實驗、運行管理效率更高，可接待更多人次的機器使用預約。
二、樣品模塊變溫速度影響PCR產物特異性
在PCR儀服務工作中，屢屢聽到科研人員反映：同一個片段，用某品牌PCR儀可以有效擴增，換個品牌機器擴增會失敗。雖然所言具體細節難以確認，但其實這反映的是PCR和qPCR實驗結果可重復性的問題。
熱循環模塊升降溫速度對PCR產物特異性有影響，這在業內是有共識的。
Eppendorf的資料說明，PCR樣品在變性-退火-延伸三個步驟間的升降溫速率屬性，影響PCR 結果可重復性。PCR反應模塊溫控速率的變化，會使PCR產物凝膠電泳帶型改變。這在隨機擴增多態性DNA 分析（RAPD）實驗中表現尤為顯著。此外。變溫速率的不穩定對PCR實驗結果的危害，類似于模塊控溫誤差帶來的干擾。
短串聯重復序列(STR) 在基因組中的重復數量在個體間呈高度多態性。采用PCR儀擴增STR的檢測分析是物種系統發育、司法物證與民事親子鑒定等領域的重要手段。耶拿公司人士認為，高速PCR擴增STR具有特異性好的巨大優勢。
說明，不僅是PCR熱循環模塊溫度控制精確性和均一性，升降溫速度控制也影響qPCR實驗結果的穩定。
眾所周知，溫度準確有效是PCR反應的靈魂。表1也顯示，20年來，PCR模塊溫度控制的均一性從±0.50℃提到±0.2℃，溫控精度一直保持在±0.2-0.3℃。提高反應模塊的溫度控制精度和內部溫度均一性，確保PCR反應組分盡可能處于設定的有利溫度而非偏離設定溫度，可提升PCR擴增效率，減少錯誤和非特異性反應。
熱循環模塊升降溫速度影響PCR反應特異性的原因在于，PCR模塊的快速變溫，使熱循環步驟中溫度轉換過程時間占比大幅縮短。反應體系處于中間過渡溫度環境的時間極大壓縮，而保持在實驗“有效溫度”的時間比例大幅增加。這相當于提升了模塊保持有效設定溫度時間的能力。
72-95℃高溫停留時間越長，PCR反應體系蒸發進入管內死腔水份越多，體系濃縮越嚴重，會使PCR擴增效率下降。而55-72℃階段，引物具有一定程度同源的核酸片段的復性延伸，爭奪體系中Taq酶和合成原料資源，對模板擴增構成競爭抑制效應。反之，循環過程溫度偏離設定點少，擴增失誤少，必然有助于提高擴增產物產量并減少異常溫度條件下引起的非特異結合。PCR可靠性增高，實驗結果可重復性改善則順理成章。
qPCR儀誕生20多年來，當提升模塊溫控精度和溫度均一性潛能掘盡后，改進模塊工藝材料和溫度控制元件性能，大幅加快熱循環模塊升降溫速度，成為實時熒光定量PCR儀發展史上具有里程碑意義的進步。
目前主流qPCR儀，如伯樂最新上市的CFX Opus 96系統，其96-Well Fast模塊最大升降溫速率為5℃/s（平均升降溫速率3.3℃/s）。賽默飛QuantStudio 6 Flex實時熒光定量PCR儀的96×0.2mL模塊最高升溫速率可達6.5℃/s，而96×0.1mL模塊這一指標已躍升至9.0℃/s。
羅氏LightCycler 2.0的毛細管離心式反應模塊，升溫速度更是高達20℃。其初衷就在于盡可能減少溫度過渡時間，從而把樣品體系鎖定在設定溫度上，確保PCR檢測性能。三、qPCR儀快速升降溫能力讓快速PCR功能如虎添翼
一般認為，快速PCR儀/qPCR儀意指PCR模塊具有快速變溫能力（通常升溫速度不低于5.0℃/s），比普通PCR反應模塊可有效縮短反應時間。業內將升溫速度達到4℃配置0.1mL模塊的qPCR儀冠名為快速實時熒光定量PCR儀，以區別于標準0.2ml模塊機型。
而快速PCR功能是指PCR熱循環過程采用快速反應模式。核心是qPCR儀系統預置快速反應功能模式，并不局限于具備超快升降溫速度模塊。賽默飛StepOnePlus實時熒光定量PCR儀，就有標準模式和快速反應模式，雖然其最高升溫速度僅4.6℃/s。同樣的，7500 Fast（升降溫速率5.5℃/s）也支持快速模式和標準模式兩種運行程序。快速運行功能模式，可在40分鐘內完成標準模式下近2小時的擴增任務。
通常，要實現快速PCR反應，必須三管齊下。
一是用薄壁0.1mL PCR管或PCR板(如伯樂low-profile耗材)和專用0.1mL Fast反應模塊。模塊升降溫迅速是基礎，而壁薄導熱迅速，加之反應體積小，升降溫變得更敏捷；
二是壓縮熱循環各步驟的保持時間，這是有效且立竿見影的舉措。譬如根據模板片段長度，將退火15s縮短為5-10s，延伸時間由30s縮短至10-15s。如果引物的退火和延伸溫度相差無幾，則可將它們合并，這樣變標準PCR程序變性96℃、56℃退火、72℃延伸三步為95℃變性、72℃延伸兩步后，可進一步縮短PCR運行時間。
三是采用高擴增能力DNA聚合酶，這是實現快速PCR和PCR擴增穩產高產的關鍵。高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸時間僅需常規Taq聚合酶1/3-1/2的時間，即可維持較高擴增效率。
可見，qPCR儀的快速升降溫能力與快速PCR功能模式，相互獨立又能相互協同，珠聯璧合，有助于實現快速高效PCR分析檢測。四、實時熒光定量PCR儀升降溫速度性能的意義
在明確qPCR儀熱循環模塊升降溫速度對實驗結果穩定性的提質、和對實驗管理效率增效的作用后，速度快、精度高、均一性好就可作為實時定量PCR儀選型的重要策略。
當升降溫速度接近時，0.2ml標準反應模塊的實時熒光定量PCR儀既有快速變溫優勢，又能照顧多數人的實驗習慣，無疑非常穩妥。而0.1ml快速反應模塊具有支持10～30ul小體積、反應管內蒸發死腔小、壁薄熱導效率高、樣品升降溫效能高特定，在滿足檢測限度要求情況下，工作效能無疑要更高。
如果要為實驗平臺用的實時熒光定量PCR儀劃一個控溫性能指標，升溫速度達到多少才算“先進、夠用”？我們不妨看看在國外高IF刊文中牛人用的是何種性能檔次的qPCR系統。
表3 2019至2021 qPCR實驗儀器型號與發文數量表
品牌型號 ABI 7300 ABI 7500 ABI 7500 Fast ABI StepOne Plus ABI
ViiA 7 ABI QuantiStudio系列 Bio-Rad
CFX96 系列 Roche
LightCycler 480 II
上市年份 2004 2004 2005 2007 2010 2013/2018 2018/2018 2008
升溫速度 1.6℃/s 2.5℃/s 5.5℃/s 4.6℃/s 5.5℃/s 3.5-6.5℃/s 5.0℃/s 4.8℃/s
檢索詞  7300 Real-Time PCR 7500 Real-Time PCR 7500 Fast Real-Time PCR StepOne Plus ViiA7 + PCR QuantiStudio CFX96 Touch、
CFX96 Real-Time PCR LightCycler 480 II
發文數量 1239篇 4269篇 2959篇 61篇 1190篇 39篇 2518篇 974篇
備注 檢索選項:[Text Word]
檢索時間跨度："2019/01/01"[PubDate] : "2021/08/01"[PubDate]
（數據來源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）
表3顯示，論文中使用最多的是7500型，其次是7500 Fast、CFX96、7300、ViiA7、LightCycler 480 II、StepOne Plus和QuantiStudio系列機型。上市較早、升溫速度2.5℃/s的7500竟遠超同期上市、升溫速度更快7500 Fast、LightCycler 480 II及后起之秀ViiA7和伯樂CFX96型實時熒光定量PCR儀。
表4 高影響因子發文作者單位舉例
品牌機型 發文單位/期刊名稱
ABI 7300 J. Exp. Med. (2021)
Cornell University College of Veterinary Medicine Cell Death and Disease(2021)
Huashan Hospital, Fudan University Stem Cell Research & Therapy(2021)
Chinese PLA General Hospital & Tsinghua University, Shenzhen Nat Commun(2021)
School of Basic Medical Sciences, Shandong University eLife(2021)
University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh
ABI 7500 Cell Death and Disease(2021)
Zhongshan Hospital Qingpu Branch,Fudan University Cell Death and Disease(2021)
Fudan University Cell Death and Disease(2021)
Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine J Exp Med.(2021)
Cornell University College of Veterinary Medicine Cell Death and Disease(2021)
Soochow University
（數據來源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）
在IF 8.0以上期刊眾多文章中，既有不差錢的美國研究機構，也有諸如復旦大學及附屬醫院、上海交大附屬醫院、清華深圳研究院、山東大學、蘇州大學等科研條件較好的國內院校。在國內外學術達人手中，面世已16年的7300和7500兩款老qPCR儀，依舊熠熠生輝。使用了其檢測數據的研究結果被榮幸刊發在J. Exp. Med.、Nat Commun這類Top級牛刊上。
話說回來，調研證實，升溫速度快的7500Fast、7500實時熒光定量PCR儀發文用戶，顯然比7300的用戶多得多。說明更高更快的運行體驗更受科研人員待見，這是事實。
就小型實驗室qPCR儀而言，對比QuantiStudio 1(最高升溫速率3.5℃/s，三檢測通道)和CFX Concet(最高升溫速率5.0℃/s，平均升降溫速率 3.3℃/s，三檢測通道)，CFX Concet變溫速度更高，實驗效能更高。參考文獻
Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.Clinical Chemistry,2009 Apr;55(4):611-22
吳瀟韞,王忠華.德國耶???應用驅動型qPCR儀選型攻略-1

        MIQE指南（The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments），即實時熒光定量PCR實驗發表所需提供的最少實驗細節信息指南，為RT-qPCR全流程實驗操作和研究論文編訂建立了一個完整規范體系，既便于期刊編審對文章技術質量進行評價，又確保文中的實驗方法和數據的可重復性。

        關于qPCR protocol，指南規定Manufacturer of qPCR instrument為essential information（E類）。實驗所用儀器的制造商品牌屬必須提供的基本信息。

        據常識，各品牌通常有部分型號qPCR主機可配置多個不同功能類型樣品模塊，模塊間溫控特性、樣品體積和支持熒光檢測通道數會有所別。以伯樂CFX Opus實時熒光定量PCR儀為例，96孔模塊最高升溫速度為5℃/s，而384孔模塊速度僅2.5℃/s。因此，qPCR儀技術規格信息詳實披露，有助于他人參考、模擬各項反應條件進行實驗重復。

        阿拉斯加科技新近完成的調研顯示，目前J Exp Med、Nat Commun、elife、Sci Adv等刊發的文章中，通常都注明了qPCR儀器具體型號和（或）樣品反應模塊規格。常見表述方式有：

       【qPCR analysis was carried out with Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)】

       【qPCR was performed on a 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)】

       【All reactions were analyzed in an Applied Biosystems PRISM 7500 Fast Real-Time PCR system in 96-well plate format】

        業內外常將熒光檢測模塊逐孔檢測或整板成像、熒光校正ROX染料使用與否、熒光檢測通道數、臨床診斷的應用及擴增曲線是否平滑等問題與實時熒光定量PCR儀性能優劣相關聯進行評價，歷來爭論不休。本文圍繞qPCR儀樣品反應模塊升降溫速度控制對PCR擴增檢測效能的作用和意義展開討論。

一、樣品模塊的變溫速度決定PCR實驗效率

        MIQE指南成文之時，Applied Biosystems的7300（96×0.2ml/4色）、7500 Fast（96×0.1ml/5色）、StepOne（48×0.1ml/3色）及StepOnePlus（96×0.1ml/4色）風頭正盛。伯樂的MyiQ（96×0.2ml/單色）及iCycler iQ（96×0.2ml/4色）差點事，就乘機并購了MJ Research公司，把DNA Engine Opticon 2（96×0.2ml/雙色）和Chromo 4（96×0.2ml/4色）收入囊中后推出MiniOption（雙色）、iQ5（96×0.2ml/5色）qPCR儀。羅氏的LightCycler 1.5（32×20μl毛細管/3色）一看不行，開始發力主推大眾化的LightCycler 480 II（96×0.2ml或384孔板/6色）。Stratagene Mx3000P（96×0.2ml/4色）/Mx3005P（96×0.2ml/5色）于2007年并入Agilent而一息尚存。但eppendorf Mastercycler ep realplex2 (96×/0.2ml雙色)、realplex4 (96×0.2ml/4色）則成為了歷史。Qiagen的Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀與LightCycler 1.5可謂異曲同工，死扛72×100μl、100×30μl離心轉頭式反應模塊。

        這一眾品牌的實時熒光定量PCR系統，采用的熱循環模塊的溫度控制性能是有區別的。

表1 部分經典型號qPCR系統工作性能參數表

         常規應用中，qPCR儀工作時程是由PCR程序運行進度決定的。

         樣品溫度在變性、退火和延伸三個溫度臺階轉換的快慢完全取決于模塊變溫速度。同一個模板、相同組分體系，反應模塊熱升降溫速度不同，執行同一PCR程序耗時大不相同。尤其是變性-退火轉換步驟，溫差高達35-40℃，不同熱循環模塊溫度切變耗時懸殊。

       以Veriti PCR儀主板預置的“常規PCR擴增程序”為例：94℃預變性1min→95℃變性15s+55℃退火15s+72℃延伸30s共35個循環→最后72℃延伸7分鐘結束反應→4℃保溫。每個循環中樣品處于有效工作溫度時長僅1分鐘，但須經歷一次94℃→55℃相對較慢的降溫過程和一次55℃→72℃相對快速的升溫過程。

       如果把55℃→72℃進程喻為田徑百米決賽，則94℃→55℃轉換過程就相當于20公里競走。東京奧運會蘇炳添成績9.98s排名第六，但與冠軍成績僅區區0.18s之差。競走決賽中，選手王凱華排名第七但要比奪冠成績落后了228s。選手速度實力差距放到拉長的賽程后，就變得顯而易見。不同機型在進行PCR循環中這一升一降兩個動作耗時存在顯著差距的道理亦是如此。

        qPCR儀用戶指南通常標明了儀器安裝運行的海拔高度、環境溫度、濕度、通風條件參考范圍。而熱循環模塊降溫速度除了環境條件還受所加載樣品體積的制約。每個型號實時定量PCR儀實際降溫速度，除了具體現場測試別無他法。我們討論模塊變溫速度，其實是基于“模塊升溫速度快，散熱效率理應較高”的假設和經驗估算而已，并無真憑實據。

        若以實時熒光定量PCR儀額定變溫速率估算PCR循環的升降溫過程，將得到表2的結果。 

表2 PCR循環變溫過程時長估算數據表

        結果顯示，不同代差qPCR系統升溫過程中耗時差別可達2倍。但最大升溫速度5℃/s-6.5℃/s的機型間比較，升溫過程時長區別不大。 

        儀器標稱Peak Ramp Rate，是熱循環模塊按默認最高變溫速度模式運行時瞬時速度極限，與實際穩定運行升溫速度（以2-4℃居多）有相當差距。因此，有人認為，品牌PCR儀熱循環模塊實際變溫速度差并不大，以每個循環時差20秒、35個循環計算，時差不過12分鐘，完全可以忽略。其實這種論點不妥，原因有二。

        一是不完全符合事實。模塊工藝技術代差相同的PCR儀，如GeneAmp 2720和伯樂Mycyler，二者完成相同protocol時長固然接近。但模塊變溫性能差距拉大到一定程度后，如2720 VS SimpliAmp 、VeritiPro 、Proflex 以及C1000 touch PCR儀，恐怕2720的起舞節奏難免要遭吐槽。這一點，從eppendorf官方實測報告可以佐證。

表3 主要品牌熱銷PCR儀完成相同實驗運行時間表

        二是論據存在疏漏。人們只盯著升溫速度，卻忽略了94℃→55℃過程降溫速度這個關鍵瓶頸因素。PCR循環相當部分時間其實就浪費在這一步。若降溫速度以2.0℃/s估算，表中的程序降溫所耗時長差不多是升溫耗時的3-4倍。7500和QuantStudio 1兩款機型降溫速率相差僅0.4℃/s，但前者耗時近30秒，后者為20秒左右，完成單次循環二者耗時相差超過10秒。

       可見，在PCR熱循環中，降溫速度的微小差異會在實際運行中被數倍放大，從而明顯拉大不同qPCR系統任務完成時差。伯樂Mycycler PCR儀（最快升溫速度2.5℃/秒）完成35個循環擴增，耗時據稱超過2個半小時。當今主流96×0.2mL標準模塊SimpliAmp PCR儀及QuantStudio 3 qPCR儀，完成35個標準曲線定量實驗流程，運行時長不會超過2小時。

       同種反應模塊配置，快速變溫能力，意味著實驗、運行管理效率更高，可接待更多人次的機器使用預約。

（待續）